Proteinase K: egenskaper, enzymatisk aktivitet og applikasjoner

Proteinase K er et enzym som tilhører gruppen av serinproteaser, det vil si at den i sitt aktive katalytiske senter har en aminosyre serin og har funksjonen til å bryte peptidbindinger ved hydrolyse. Dette enzymet tilhører i sin tur familien av subtilisinproteiner (peptidase S8).

Proteinase K har en molekylvekt (MW) på 28 900 dalton og ble isolert for første gang i 1974 fra ekstrakter av svampen Engyodontium-albumet, tidligere kjent som Tritirachium-album Limber.

Det presenterer en høy proteolytisk kapasitet, demonstrert for å kunne nedbryte keratin tilstede i håret. Ordet keratin på engelsk er skrevet "keratin", derfor har det blitt kalt "proteinase K".

På grunn av sin høye kapasitet til å spalte native proteiner, er dette enzymet nyttig i forskjellige molekylærbiologi teknikker. Det brukes hovedsakelig til å isolere og forberede nukleinsyrer med høy molekylvekt (MW).

Proteinase K virker ved å frigjøre det nukleære DNA, mens ødeleggelsen av proteiner og inaktiverer RNaser og DNaser, det vil si eliminerer nukleasene i DNA- og RNA-preparatene.

På den annen side har det blitt sett at proteinase K kan hydrolysere noen denaturerte, native proteiner, som har vekket interesse for forskere for bruk i studiet av prionproteiner (PrP C).

Til tross for dens høye proteolytiske potens er det imidlertid proteiner som er resistente mot proteinase K-virkningen. Blant dem er det noen unormale proteiner kalt prioner (PrP Sc), forbundet med overførbare spongiforme encefalopatier.

Egenskaper av proteinase K

Proteinase K har en tertiær struktur dannet av tre lag, med et p-ark med syv kjeder spaltet mellom to lag av helikser. Fordi den tilhører S8-peptidasefamilien, kjennetegnes den av å ha en katalytisk triad i sitt aktive sted, hvis rekkefølge er (Asp, His og Ser), som skiller dem fra andre peptidasefamilier.

Dette enzymet fra gruppen serinproteaser karakteriseres ved hydrolysering av peptidbindingene nær karboksylgruppen av de alifatiske og aromatiske aminosyrer.

På den annen side er det i stand til å virke i nærvær av visse korroderende stoffer, som natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL og EDTA, som brukes til å bidra til denaturering av proteiner, slik at de mister sin opprinnelige struktur.

Dette er et foreløpig trinn i fremstillingen av proteiner for elektroforese teknikken. PH-området ved hvilken proteinase K virker, er ganske bred (2, 0 til 12, 0), med en optimal pH mellom 7, 5 og 12, 0, og dens isoelektriske punkt er 8, 9. Som det kan ses, er det aktivt mot et meget bredt spekter av pH.

En annen egenskap som skiller seg ut i proteinase K er stabiliteten i nærvær av høye temperaturer (50 - 60 ° C).

Enzymatisk aktivitet

Proteinase K trenger tilstedeværelse av kalsiumion, selv om dette ikke påvirker dets aktivitet, dersom det er viktig å opprettholde stabiliteten.

For at proteinase K skal utføre fullstendig fordøyelse av substratet, er det nødvendig med en omtrentlig kontakttid på mellom 5 minutter og 2 timer.

Imidlertid i denne forstand Daza et al. Sammenlignet med renheten av DNA oppnådd ved forskjellige eksponeringstidspunkt for proteinase K, og konkluderte med at en langvarig inkubasjon (opptil 24 timer) signifikant forbedrer DNA-kvaliteten.

Nå, i forhold til konsentrasjonen som brukes av enzymet proteinase K i de forskjellige protokollene, kan det sies at det er svært variert.

Den kan brukes fra svært lave konsentrasjoner (5 μg / ml) til konsentrasjoner på 500 μg / ml. Men de hyppigste arbeidskonsentrasjonene varierer mellom 50-100μg / ml, spesielt for proteinfordeling og nukleaseinaktivering. Selv om en konsentrasjon på 2 mg / ml er nødvendig for vevsbehandling.

søknader

Dens applikasjoner er svært brede og kan oppsummeres i følgende:

-Det brukes i fordøyelsen av proteiner og DNA-ekstraksjon ved hjelp av flere metoder som salting out, PK-SDS, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), modifisert kaliumacetat og ekstraksjon med natriumjodid.

-Innaktivering av nukleaser (RNaser og DNaser).

-I teknikken for in situ hybridisering (HIS), for å hjelpe frigjøring av nukleinsyre, i tillegg til eliminering av uønskede proteiner.

-Modifisering av proteiner.

- På nivå av forskning, i ulike studier.

Fordeler med proteinase K

Flere komparative studier har blitt utført blant DNA-ekstraksjonsteknikker ved bruk av Proteinase K, med andre som ikke bruker det, og alle konkluderer med at det er større fordeler ved bruk av enzymet. Blant fordelene kan følgende nevnes:

- DNA med høy molekylvekt, høy kvalitet og renhet oppnås.

Det ekstraherte DNA er stabilt i opptil 3 måneder.

Det ekstraherte DNA kan brukes i følgende teknikker: Southern blot, polymerasekjedereaksjon (PCR), elektroforese, blant andre.

Proteiner resistente mot proteinase K

Flere undersøkelser har konkludert med at prioner (unormale PrPSc-toksiske proteiner) er differensiert fra PrPC-proteiner (native) fordi de er resistente mot virkningen av proteinase K, mens PrPC er følsomme overfor deres virkning.

Andre forfattere har beskrevet at i strukturen av PrPSc er det sensitive deler og andre resistente mot proteinase K. Imidlertid er begge deler like giftige og smittsomme.

På den annen side isolerte Bastian og samarbeidspartnere i 1987 4 proteiner av 28, 30, 66 og 76 kda fra en art Spiroplasma mirum . Alle var resistente mot virkningen av proteinase K og kryss-reagerte også med noen prioner.

Det er kjent at denne arten kan forårsake grå stær og viktig nevrologisk skade, og på grunn av de vitenskapelige funnene fra Bastian, blant annet har det blitt forsøkt å knytte denne mikroorganismen til overførbare spongiforme encefalopatier.

Imidlertid er etiologien til denne degenerative nevrologiske patologien fortsatt tilskrevet prioner.

På denne måten identifiserte Butler og samarbeidspartnere i 1991 og karakteriserte en klasse av 40 Kda proteinase resistent protein fra to stammer av Mycoplasma hyorhinis. Dette patogenet påvirker griser, infiserer vevet, men i dette tilfellet var det ingen kryssreaksjon med de testede prionene.

Mer forskning er nødvendig for å belyse mange ukjente om det.