Katalasertest: grunnlag, teknikk og bruk
Catalasetesten er en metode som brukes i bakteriologilaboratorier for å demonstrere tilstedeværelsen av katalasenzymet i de bakteriene som besitter den. Sammen med Gram-fargestoff er de viktigste testene som skal utføres på nylig isolerte mikroorganismer. Disse testene veileder mikrobiologen om trinnene som skal følges for den endelige identifiseringen av mikroorganismen i spørsmålet.
Generelt inneholder bakterier som inneholder cytokrom katalaseenzymet, det vil si at aerobe og fakultative anaerobe bakterier burde ha det. Imidlertid er det unntak, som Streptococcus, som til tross for at fakultative anaerobe mikroorganismer ikke har katalaseenzymet.
Det er derfor katalasetesten brukes hovedsakelig for å skille familien Staphylococaceae og Micrococaceae (begge katalase-positive) av familien Streptococaceae (katalase negativ).
På samme måte er slekten Bacillus (katalase positiv) skilt ut fra slangen Clostridium (katalase negativ), blant andre.
fundament
Catalase er et enzym klassifisert som hydroperoxidase, dette betyr at de bruker hydrogenperoksid (H 2 O 2 ) som substrat.
Det betraktes også som en oksidoreduktase, siden i reaksjonen hvor det er et element som tjener som en elektrondonor (reduserende substans) og en annen som en elektronreseptor (oksidantstoff).
Catalase er et protein som inneholder en protetisk gruppe med fire trivalente jernatomer (Fe +++), derfor er det et homoprotein. Ferrionen forblir oksidert under reaksjonen.
Det kan sies at katalase er et avgiftende enzym, siden funksjonen er å eliminere stoffer som produseres under bakteriell metabolisme som er giftig for bakterier. Blant disse stoffene er hydrogenperoksid.
Hydrogenperoksid er dannet fra dekomponering av sukker ved aerobruten. Denne prosessen skjer som følger:
Superoksydionen (O 2 -) (fritt radikal) dannes som sluttproduktet av assimilering av glukose ved aerobruten. Dette er toksisk og elimineres av enzymet superoksid dismutase som forvandler det til gassformig oksygen og hydrogenperoksid.
Hydrogenperoksid er også giftig for bakterier og bør elimineres. Catalasenzymet utfolder hydrogenperoksid i vann og oksygen.
Katalase kan virke på andre substrat enn hydrogenperoksid, slik som alkoholer, aldehyder, syrer, aromatiske aminer og fenoler. Hydrogenperoksid kan imidlertid også benyttes ved katalase for å oksidere andre toksiske forbindelser som metyl og etylalkohol.
På samme måte er katalase tilstede i fagocytiske celler, og beskytter den mot giftig virkning av hydrogenperoksid.
Rutinemessig teknikk for katalasetesten
-Object metode
materialer
3% hydrogenperoksid (10 volumer).
Lysbilde
Engangs plasthåndtak eller trepinne.
prosessen
Ta nok av kolonien til å studere uten å berøre agaren hvor den kommer fra. Kolonien må være frisk, det vil si fra en kultur på 18 til 24 timer.
Sett kolonien på det tørre lysbildet og legg det på en dråpe på 3% hydrogenperoksid (30% H 2 O 2 kan også brukes). Vær oppmerksom på om bobler slippes ut eller ikke.
tolkning
Positiv reaksjon: gassutvikling, som fremgår av dannelsen av bobler (sterk boblende).
Negativ reaksjon: det er ingen bobleformasjon.
- Direkte metode i ren kultur
Plasser 1 ml 3% H202 på en ren kultur i plater eller kiler som ikke inneholder blod (helst næringsmiddel agar). Vær oppmerksom på om bobleformasjonen eksisterer umiddelbart. Du kan også bruke H 2 O 2 ved 30%.
Det tolkes på samme måte som objektportingsmetoden.
-Metode med kapillærrør eller Fung og Petrishko
Fyll en 67 mm kapillærrør i en høyde på 20 mm med 3% hydrogenperoksid ved kapillaritet.
Berør den isolerte kolonien du ønsker å studere med kapillær fylt med 3% H 2 O 2 . Vær oppmerksom på om kapillæren er fylt med bobler i ca. 10 sekunder. Denne metoden gjør det mulig å semi-kvantifisere reaksjonen i krysser:
Uten kryss er det ingen bobler (negativ reaksjon).
+ ---- Lite bobler (svak eller forsinket reaksjon).
++ Rikelig bobler (moderat reaksjon).
+++ - Bobler når motsatt ekstreme (energisk reaksjon).
-Taylor og Achanzar-metoden for katalasertester som gir tvilsomhet
På en ren, tørr lysbilde plasser en isolert koloni, legg deretter en dråpe på 0, 5% H 2 O 2 og dekk med et deksel. Vær oppmerksom på om det er dannelse av fanget bobler eller ikke.
Tolkning: Tilstedeværelsen av bobler indikerer en positiv reaksjon. Uten bobler tolkes det som en negativ reaksjon.
Katalasertest for Mycobacterium-arter
Denne teknikken må gjøres ved å kontrollere pH og temperatur. Den må kjøres under en laminarstrømshett, da håndtering av de forskjellige Mycobacterium-artene er farlig.
-Materialer
Hydrogenperoksid med 30% eller 110 volum (superoksal).
PH 7 fosfatbuffer
10% Tween 80
Dyrking av Mycobacterium kile 3 til 4 uker
-Preparasjon av reagenser
PH 7 fosfatbuffer
Regret:
1, 361 g vannfritt monokaliumfosfat (KH2P04).
1, 420 g vannfritt dinatrium (Na2HPO3) fosfat.
Oppløs begge salter i et lite sterilt destillert vann og fullfør med vann opptil 1000 ml.
10% Tween 80
Lag en 1:10 fortynning til Tween 80 som kommer kommersielt konsentrert, så fortsett som følger:
Ta 1 ml Tween 80 og plasser den i litt destillert vann, oppløs og fyll deretter volumet med vann til 10 ml.
Endelig reagens
Bland en mengde fosfatbuffer med en mengde på 10% Tween 80 (i like deler). Definer i laboratoriet hvor mye du vil forberede.
-a prosedyre
Plasser 5 ml fosfatbuffer i et sterilt reagensrør med en skruehett (Bakelite).
Med en inokuleringssløyfe, ta nok koloni av en vekst av Mycobacterium såpet i kiler og oppløs i fosfatbufferen.
Dekk røret uten å trekke tråden for mye. Plasser i et vannbad ved 68 ° C i 20 til 30 minutter. Fjern og la avkjøle ved 22-25 ° C
Mål 0, 5 ml av det endelige reagenset (blanding) og legg det til røret med den kalde løsningen. Vær oppmerksom på dannelsen eller ikke av bobler.
Det tolkes som tidligere teknikker.
bruk
Når en vekst av kolonier i beriket medium oppnås, bør en Gram-flekk og en katalasetest utføres på de oppnådde kolonier. Dette vil veilede mikrobiologen om prosedyrene som skal følges for endelig identifikasjon.
Kvalitetskontroll
For å evaluere riktig funksjon av hydrogenperoksidreagenset, bruk nykulturerte kontrollstammer, slik som Staphylococcus aureus som en positiv kontroll og stammer av Streptococcus sp som negativ kontroll.
Et annet alternativ som tjener som en positiv kontroll er å legge en dråpe hydrogenperoksid på blodagaren, erytrocytene har katalase, derfor vil det bli en boblende hvis reagenset er i god stand.
En sjokoladeagar kan brukes som negativ kontroll, her er erytrocytene allerede lysert og testen er negativ.
begrensninger
- Ikke bruk gamle kulturer for testen, da dette kan føre til falske negativer.
-Avoid ta kolonier fra kulturer i blodagar, hvis det tas forsiktighet for ikke å berøre agaret; Denne prosedyren kan forårsake falske positiver, siden erytrocytter inneholder katalase.
-Hvis du tar kolonien med platinhåndtak, må du ikke reversere rekkefølgen av prosedyren fordi dette kan generere falske positiver. Dette skyldes at platina er i stand til å reagere med hydrogenperoksid, noe som forårsaker boblende.
- Ikke bruk hydrogenperoksidreagenset hvis det er for gammelt, da reagenset er svært ustabilt og har en tendens til å dekomponere med tiden.
- Hold hydrogenperoksidreagenset beskyttet mot lys og i kjøling for å unngå skade.
- Utfør en kvalitetskontroll av hydrogenperoksidreagenset hver gang det brukes.
- Vær oppmerksom på at hvis H 2 O 2 brukes til 30%, er reaksjonene sterkere enn de som er laget med 3% H 2 O 2 .
