Malonato buljong: grunnlag, forberedelse og bruk

Malonatbuljongen er det flytende dyrkingsmediet som brukes til den diagnostiske testen (malonato-test), som brukes til å skille mellom noen genera av familien Enterobacteriaceae. Den ble opprettet av Leifson i 1933 og senere endret av Ewing, som la til en liten mengde dextrose og gjærekstrakt til den opprinnelige formelen.

Mediet er for tiden sammensatt av gjærekstrakt, ammoniumsulfat, dikaliumfosfat, monokaliumfosfat, natriumklorid, natriummalonat, dextrose og bromtymolblått. Denne testen er vanligvis inkludert i det biokjemiske identifikasjonsbatteriet for Enterobacteria, som bidrar til å skille mellom bestemte genera og arter.

Malonat-testen er hovedsakelig basert på muligheten for enkelte mikroorganismer til å bruke natriummalonat som eneste karbonkilde og ammoniumsulfat som nitrogenkilde.

Malonatprøven er vanligvis positiv i noen arter av slaktene Enterobacter, Klebsiella og Citrobacter. Mens de fleste arter av slægten Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus og Providence gir negativ reaksjon.

fundament

Malonatprøven består i å demonstrere de bakterier som er i stand til å bruke natriummalonat som den eneste karbonkilden og ammoniumsulfatet som nitrogenkilde.

De fleste enterobakterier som ikke bruker malonat, er i stand til å vokse i dette mediet, og tar dextrose og gjærkstrakt som næringsstoffer.

I dette tilfelle vil ethvert forsøk på alkalisering ved bruk av peptonene motvirkes ved fremstilling av syrer generert ved gjæring av dextrose. På samme måte virker dikalium- og monokaliumfosfater som en buffer som opprettholder pH ved 6, 7.

Det er derfor, når testen er negativ, er buljongen den samme originale fargen (grønn). I sjeldne tilfeller kan mediet surgjøres på grunn av fermentering av dextrose; uten bruk av peptonene, og pH-indikatoren vil vende mediet til farge mot gul. For at dette skal skje, må pH senke til 6.

Nå, når denne testen er positiv, sies det at mikroorganismen brukte malonat og ammoniumsulfat som henholdsvis karbon og nitrogenkilder uten å benytte de andre komponentene.

I dette tilfellet blir mediet alkalisk på grunn av frigjøring av natrium og den resulterende dannelse av NaOH. I denne forstand, viser pH-indikatoren (bromothymolblått) fargen fra grønt til blått når pH er lik eller større enn 7, 6. Blåen kan være klar eller intens (prussian blue).

Endelig opprettholder natriumklorid osmolariteten til mediet og vann er fortynningsmiddelet til alle komponentene.

tolkning

Broth av samme farge (grønn): negativ test

Gul buljong: negativ test

Lyseblå eller intens kjøttkraft: positiv bevis

Det finnes en variant kalt fenylalaninmalonatbuljong, også kalt Shaw og Clarke medium. I dette tilfellet kan to tester analyseres, bruk av malonat som karbonkilde og produksjon av pyruvsyre fra fenylalanin.

forberedelse

Malonato buljong

Mengden gram spesifisert av innsatsen til det valgte kommersielle huset veies (det kan variere fra den ene til den andre). Tungt gram suspenderes i en liter destillert vann. Varm litt til helt oppløst. Fordel 3 ml mediet i 13/100 reagensrør med et bomullsdeksel.

Steriliser i en autoklav ved 121 ° C i 15 eller 20 minutter.

Kjølig før bruk. Hvis de ikke skal brukes umiddelbart, oppbevares i kjøleskapet til bruk. Tørk buljongene ved romtemperatur før de inokuleres.

PH i mediet bør være 6, 7 ± 0, 2. Fargen på det tilberedte mediet er flaskegrønt.

Fenylalaninmalonatbuljong

Veid 11 g av dehydratiserte medium og oppløs i 1 liter destillert vann. Resten av preparatet er det samme som det som er beskrevet ovenfor.

Den kan også fremstilles ved å tilsette 2 g / l fenylalanin til malonatbuljemediet før det steriliseres.

bruk

Den brukes som en del av batteriet av biokjemiske tester som er samlet for identifikasjon av bakterier av familien Enterobacteriaceae.

Hjelp å skille mellom:

-Slaget Klebsiella og Enterobacter (+) av slekten Escherichia og Serratia (-).

-Artypene Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame og Salmonella enterica ssp diarizonae (+), av arten Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Fra slekten Klebsiella generelt (+) av slekten Actinobacillus (-).

-Det kan noen ganger bidra til differensiering av slægter og arter av bakterier som ikke tilhører Enterobacteriaceae-familien, som for eksempel mellom ikke-fermenterende Gram-negative baciller Alcaligenes faecalis (+) og Acinetobacter sp (-).

prosessen

Under en lighter blir en del av en ren koloni tatt, ved hjelp av et platina håndtak ordentlig sterilisert og avkjølt. Prøven tatt (lys inokulum) oppløses i malonatbuljongen. Den inkuberes med det løse lokket i aerobiosis ved 35 ° C ± 0, 2 i 24 til 48 timer.

Malonatbuljongen kan også inokuleres fra en kultur på 18-24 timer i tryptikase-soyabuljong. I dette tilfellet tas 0, 01 ml med en steril pipette og malonatbuljongen inokuleres. Den inkuberes med det løse lokket i aerobiosis ved 35 ° C ± 0, 2 i 24 til 48 timer.

På slutten av tiden tolkes resultatene. Eventuelle spor av blå farge kulminert etter 48 timers inkubasjon bør anses å være positive. Testen skal ikke tolkes som negativ inntil inkubasjonstiden på 48 timer er fullført.

Ved bruk av fenylalaninmalonat-buljongvarianten blir malonat først tolket og deretter tilsettes 5 dråper 1N HCL og 3-5 dråper ferriklorid 8%. En mørkegrønn farge tolkes som en positiv test for fenylalanin. Hvis derimot blir mediet blekblått, er testen negativ for fenylalanin.

Kvalitetskontroll

For å utføre sterilitetskontrollen av mediet bør en eller to buljonger inkuberes ved 35 ° C ± 0, 2 i 24 timer inkubasjon. På slutten av denne tiden bør det ikke være turbiditet, ingen endring av farge.

For kvalitetskontroll kan kjente eller sertifiserte stammer brukes, for eksempel: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 og Escherichia coli ATCC 25922.

De forventede resultatene er:

  • Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae og Salmonella enterica ssp arizonae gir positiv reaksjon (medium blå farge).
  • For Escherichia coli må resultatet være negativt, det vil si at det ikke er forventet at det er noen endring i farge (grønn) eller at den blir gul på grunn av fermentering av glukose.

begrensninger

Ikke bruk buljong som viser turbiditet, utfelling, fargeendring eller tegn på forringelse.